Artigo Original 1 - Ficocianina na Terapêutica de Lesões Cutâneas Induzidas em Ratos Envelhecidos

Abstract

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da fi cocianina na terapêutica de lesões cutâneas induzidas em ratos envelhecidos.

Utilizaram-se 40 ratos machos envelhecidos com lesões de pele induzidas, divididos em 4 grupos: G1 (Ficocianina

10%); G2 (Ficocianina 20%); G3 (Ficocianina 30%) e G4 (Controle positivo - Kollagenase®). Essas lesões foram analisadas

quanto à contração cicatricial, quantidade de colágeno total, fi brose e células infl amatórias. Para análise estatística,

foram utilizados o software Bioestat 5.0 e a comparação entre os tratamentos e, entre os parâmetros, foi utilizado

o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em nível de signifi cância de 5%. Os resultados com a pomada fi cocianina

nas diferentes concentrações não apresentaram diferença estatística signifi cativa quando comparados aos resultados

da pomada Kollagenase®, porém, a pomada fi cocianina na concentração de 30% mostrou resultado semelhante

à pomada de referência. Conclui-se que o uso da fi cocianina em uma concentração de 30 % contribuiu positivamente

para cicatrização de feridas cutâneas em ratos.

DESCRITORES: Cicatrização. Ficocianina. Envelhecimento.

INTRODUÇÃO

A pele é um órgão complexo, no qual a interação celular

e molecular reguladas de modo preciso governam muitas

das agressões provindas do meio ambiente. É constituída

por vários tipos de células interdependentes responsáveis

pela manutenção da sua estrutura normal. Com o envelhecimento

cronológico cutâneo, ocorre a modi cação do

material genético por meio de enzimas, alterações proteicas

e o decréscimo da proliferação celular1. Esses eventos

promovem a perda de tecido, da elasticidade e da capacidade

de regular as trocas gasosas. A replicação do tecido se

torna menos e ciente. As oxidações químicas e enzimáticas

envolvendo a formação de radicais livres (RL) aceleram o

processo de senescência2.

Com o envelhecimento, ocorrem modi cações nas células,

resultando em uma diminuição da imunidade devido

à redução das células de Langerhans, aumentando, dessa

forma, o risco de lesões na pele. Aliado a isso, ocorre também

a diminuição dos melanócitos, o que reduz a proteção

aos raios solares, a diminuição da produção de suor pelas

glândulas sudoríparas, (resultando numa menor capacidade

de termorregulação), bem como a redução da vascularização

e da produção de colágeno3. Uma das consequências

das lesões de pele é a prevalência da polifarmácia, aumentando

o risco de reações autoimunes, porque a administração

concomitante de vários medicamentos pode criar uma

sensibilidade muito maior para erupções da droga, podendo

simular outras afecções cutâneas4.

Nesse contexto, a busca de novas alternativas para o

tratamento de lesões de pele torna-se bastante importante.

Existem perspectivas de desenvolvimento de novas tecnologias

que visam a acelerar o processo cicatricial e reduzir as complicações

que essas lesões podem acarretar5.

A cicatrização é reconhecida como um processo sistêmico

que consiste em uma complexa sequência de eventos

coordenados e desencadeados pelo organismo que objetiva

reconstruir o tecido lesado sendo este substituído por tecido

conjuntivo vascularizado  broso5,6. Inicia-se com resposta

in amatória caracterizada pelo aumento do  uxo sanguíneo,

permeabilidade capilar, migração de leucócitos para

a região lesada e extravasamento de plasma, formando o

exsudato in amatório7,8.

A cicatrização das feridas de espessura parcial ocorre

por regeneração das células epiteliais na superfície da ferida,

essas células migram em direção à área lesionada, proliferando-

se por mitose e incorporando-se à camada epitelial9.

Já, nas feridas de espessura total, o processo de cicatrização

ocorre por segunda intenção e é bem mais complexo, envolvendo

uma sequência de eventos moleculares e celulares de

forma ordenada e contínua10. Essa sequência, sob o ponto

de vista morfológico, é classi cada em três fases: in amatória,

proliferativa e de remodelamento11.

A fase in amatória e de hemostasia representa a primeira

fase de qualquer processo de cicatrização, inicia-se

com a ruptura de vasos sanguíneos e o extravasamento de

sangue e caracteriza-se pela participação ativa de inúmeras

células e fatores do sistema imunológico12. Essa fase tem

duração de 48 a 72 horas, com então aparecimento de dor,

calor, rubor e edema, sinais clássicos da in amação13.

A segunda fase é a  broblástica, também chamada de

fase reconstrutiva ou proliferativa, denominada dessa forma

porque, nesse período, a atividade predominante é a mitose

celular. Essa fase se estende de 12 a 14 dias6,9. As principais 

 características nessa fase são a formação do tecido de granulação,

neoangiogênese, deposição de colágeno, contração da

ferida e reepitelização. Para a síntese desses componentes,

os principais agentes estimulantes são as células endoteliais,

os  broblastos e os queratinócitos3 .

A terceira fase é a de remodelamento, também denominada

por alguns autores de fase de maturação, e consiste

na reorganização das  bras de colágeno e na substituição

do colágeno tipo III (imaturo) depositado de forma

desorganizada pelo colágeno tipo I (maduro) disposta de

forma organizada3 .

Em diversos setores da área de saúde, o tratamento

de feridas vem sendo um tema em destaque e a preocupação

na busca de produtos que promovam a cicatrização é

uma constante. Essa é uma prática milenar que, nos primórdios

da civilização, estava intimamente ligada a costumes

e hábitos populares e, com o desenrolar da história e

do desenvolvimento tecnológico, conquistou seu merecido

cunho cientí co9 .

Dentre as novas tecnologias, encontra-se a Ficocianina,

um pigmento extraído da Micoalga Spirulina platensis . Seu

peso seco pode chegar a 20%14 , é considerada a principal

responsável pela atividade antioxidante e apresenta capacidade

de ativar o sistema imunológico15 .

O uso desse pigmento pode acelerar os processos de

cicatrização de feridas, haja vista a sua riqueza em vitamina

A e capacidade bactericida, pela presença de 2,4,4

tricloro-2 hidroxi-difenil-éter, o qual é utilizado no tratamento

de processos infecciosos16 . O potencial terapêutico

da Ficocianina tem sido relatado para  ns terapêuticos em

humanos e também em animais17 .

A microalga possui e ciente atividade antiviral contra

vários vírus patógenos e tem também a capacidade

de aumentar a resposta imunológica e estimular a função

dos macrófagos18 .

Existem muitas informações acerca do uso da

Ficocianina como medicamento, entre elas, cita-se o

poder de cicatrização, mas ainda são insu cientes para

sua comprovação.

Ao partirmos do pressuposto que a Ficocianina acelera

o processo de cicatrização em lesões de pele, este estudo

possui o seguinte objetivo: veri car a ação da  cocianina

na terapêutica de lesões cutâneas induzidas em ratos envelhecidos

com relação à contração cicatricial, quantidade de

colágeno total,  brose e células in amatórias em comparação

com produto de referência – Kollagenase®.

MÉTODO

 Os experimentos foram realizados no Biotério Central e

no Laboratório de Bioquímica e Histologia do Instituto

de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade de Passo

Fundo (UPF). Foram adotados os Princípios Éticos em

Experimentação Animal, preconizados pelo Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal (COBEA), instituição  liada

ao International Council for Laboratory Animal Science  e a

Legislação Brasileira de Animais de Experimentação, Lei

Federal n.º 6.638 (1979).

A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade

de Passo Fundo (CEUA-UPF) aprovou o projeto desta pesquisa

com o parecer 007/2011, com registro de número 002/2011

na CEUA, que diz respeito à vida dos animais utilizados.

Foram utilizados 40 ratos (Wistar hannover ) machos,

nascidos e mantidos no Biotério Central da UPF, com idade

aproximada de 400 dias, alimentados com ração e água ad

libitum  e com ciclo claro-escuro de 12 horas. Eles foram

divididos em quatro grupos com nº de 10 animais, e cada

grupo recebeu um tipo de tratamento conforme segue:

• grupo 1 - G1 (Ficocianina 10%);

• grupo 2 - G2 (Ficocianina 20%);

• grupo 3 - G3 (Ficocianina 30%) e

• grupo 4 - G4 (Controle positivo – Kollagenase®) pomada

de referência. Durante todo o período de estudo, os

animais foram mantidos em gaiolas individuais, identi

cadas e acomodados sobre estantes horizontais.

A pomada Kollagenase®, utilizada no grupo controle,

foi usada como pomada de referência comercial no efeito

cicatrização, a qual possui Registro no Ministério da Saúde

sob nº 1.0298.0049, um  brinolítico de uso adulto com

ações terapêuticas cicatrizantes.

A Ficocianina foi obtida no Laboratório de Bioquímica

de Alimentos e de Bioprocessos da UPF. Esse pigmento

foi extraído da cianobactéria Spirulina platensis , a qual foi

procedente do Laboratório de Engenharia Bioquímica da

Fundação Universidade Federal de Rio Grande – FURG.

A manipulação dessa pomada foi realizada pela farmácia

de manipulação Artesani da cidade de Erechim/RS,

Brasil. Os excipientes para formulação da pomada foram

o extrato de Ficocianina nas porcentagens utilizadas para

cada grupo, 10, 20 e 30%, as quais foram adicionadas em

creme base na quantidade su ciente para completar a

fórmula (QSP).

 Os animais foram submetidos a jejum de 2 horas prévias

ao procedimento cirúrgico. Para os procedimentos

cirúrgicos, os ratos, após pesados, foram anestesiados com

o uso de Zoletil 50 mg, sendo administrado via intramuscular

na dose de 40 mg/kg de peso corporal no músculo da

panturrilha dos ratos.

A técnica operatória, após tricotomia, consistiu em excisão

de espessura total de pele com 20 mm de circunferência,

utilizando-se um punch para demarcar a área e auxílio

de um bisturi. A hemostasia foi realizada por compressão

digital, utilizando-se gaze esterilizada.

Para a aplicação das pomadas nos diferentes grupos,

foi realizada a limpeza da lesão com soro  siológico

(NaCl 0,9%) em jato na temperatura ambiente, o qual foi

feito através de uma seringa de 20 mL com uma agulha

40x12 mm na ponta9 . Na sequência, foram aplicadas 0,5

ml da pomada utilizada em cada grupo, quantidade su -

ciente para cobrir toda a lesão que foi mantida aberta.

Esse procedimento foi realizado durante 18 dias consecutivos

uma vez por dia.

A contração cicatricial foi avaliada através da análise

computadorizada de fotos digitais padronizadas. A documentação

fotográ ca foi feita logo após o procedimento

cirúrgico e em diferentes tempos do pós-operatório (po):

0º po; 4º dia po; 12º dia po; 18º dia po.

As imagens das lesões foram digitalizadas e analisadas

pelo programa Imagem Tool  e sua área quanti cada em

centímetros quadrados.

Cada imagem avaliada foi calibrada pelo programa,

utilizando a régua adjacente à ferida. A seguir, com auxílio

de um mouse, procedeu-se o contorno manual da imagem.

Astaxas de contração cicatricial das feridas excecionais

foram obtidas subtraindo-se a área cruenta inicial

do pós-operatório imediato, em cada animal, pela área

cruenta em cada tempo pós-operatório.

As biópsias foram realizadas no sétimo dia de

pós-operatório por excisão da área total da lesão e, em

seguida, foi praticada a eutanásia do animal biopsiado.

As amostras de feridas foram colocadas em frascos com

formol a 10%, identi cados e armazenados em temperatura

ambiente. Os40casos foram processados e confeccionadas

lâminas coradas pela Hematoxilina-eosina

e pelo Picro-sirius.

Para análise estatística, foi utilizado o software

Bioestat 5.0 e, para realizar a comparação entre os tratamentos

e entre os parâmetros, foi utilizado o teste não

paramétrico de Kruskal-Wallis, em nível de signi cância

de 5%. Comoteste post hoc , usou-se o método de Dunn.

Utilizou-se estatística descritiva para identi cação de

média e desvio padrão.

As lâminas foram analisadas por médico patologista,

o qual não obteve acesso a qual grupo a lâmina pertencia,

sendo que cada lâmina foi identi cada por número

arábico para a descaracterização. Foram analisados os

seguintes parâmetros: In ltrado In amatório, Colágeno e

Fibrose. Cada parâmetro foi categorizado como: 0=sem

valor para o parâmetro; X = pouco valor para o parâmetro;

XX = valor moderado para o parâmetro e XXX = valor

intenso do parâmetro.

Todos os casos foram analisados no mesmo microscópio

Nikon Eclipse E200, com objetivas E Plan 4X, 10 X,

20 X, 40 X.

Portanto, os valores obtidos na análise dos parâmetros

foram marcados como valores inteiros 0, 1, 2 e 3, respectivamente

aos valores 0, X, XX e XXX.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

 A Tabela 1 apresenta a média da avaliação da contração

cicatricial nos 4 grupos das feridas induzidas nos ratos no

dia 1, 4, dia 12 e dia 18.

Observa-se, na Figura 1, que o comportamento cicatricial

das feridas tratadas por qualquer uma das formulações

declinou em tamanho na mesma proporção.

Exceção nesse comportamento pode ser observada para

Ficocianina a 10%.

A Figura 2 retrata as quanti cações do colágeno total,

fibrose e células inflamatórias, resultados da análise no

sétimo dia, indicando os valores dos parâmetros. O valor

zero indica que não há valor para o parâmetro; 1 = pouco

valor; 2 = valor moderado; 3 = valor intenso.

Para compor os valores de cada parâmetro, entre

os tratamentos, foi utilizado o teste não paramétrico de

Kruskal-Wallis , em nível de signi cância de 5%. Observa-se

que não existe diferença estatisticamente signi cativa entre

os valores dos parâmetros, Colágeno, In amação e Fibrose

conforme a Tabela 2.

A Figura 3 apresenta a distribuição dos valores médios

dos parâmetros de cada tratamento, bem como seus respectivos

desvios-padrão. Apesar de o teste aplicado para

comparações dos valores dos parâmetros de cada tratamento

 não ser paramétrico (Kruskal-Wallis ), ou seja, não se basear

na média, os pesquisadores optaram por mostrar o comportamento

médio com seus respectivos desvios-padrão,

uma vez que é uma medida estatística de mais fácil visualização.

Osvalores do desvio-padrão são relativamente

altos, conforme observados na Figura 3, em particular

para a in amação.

Nesta pesquisa, utilizou-se o rato da linhagem Wistar ,

pois, biologicamente, apresenta características facilitadoras

com relação a manuseio e acompanhamento, além de boa

resistência à manipulação, agressão cirúrgica e baixo custo.

Optou-se por utilizar ratos machos, pois variações dos ciclos

hormonais das fêmeas poderiam interferir no mecanismo

do processo de cicatrização19 .

Um estudo20  evidenciou uma desaceleração da atividade

metabólica dos  broblastos com o envelhecimento

e estes perderam a sua capacidade de aderir às  bras de

colágeno, limitando a possibilidade de organização do

tecido dérmico.

A quantidade de colágeno total apresenta seu primeiro

pico de produção por volta do 7º dia após a lesão, continuando

em ascensão até o 14º dia e, após, com o decorrer 

 da fase de remodelamento, é estabelecido um equilibro entre

a síntese e a degradação das  bras colágenas21 . No presente

experimento, foi observada maior quantidade do colágeno

total das feridas excecionais do grupo G2 e G3, mostrando

que os grupos tratados com Ficocianina em maior concentração

apresentam-se em fase mais adiantada do processo

de cicatrização da lesão.

Os extratos testados de Spirulina , que dá origem a

Ficocianina, revelaram a presença de  avonóides, alcalóides

e triterpinoides. Os  avonóides são conhecidos por reduzir

a peroxidação lipídica não só através da prevenção ou

inibição da peroxidação lipídica, acreditando-se que seja

para aumentar a viabilidade de  bras de colágeno através

da promoção da síntese de DNA. Assim, a propriedade de

cicatrização de Spirulina , pode ser atribuída aos  toconstituintes

presentes nela22 .

No presente estudo, os G2 e G3, apesar de não apresentarem

valores estatísticos signi cativos, mostraram

valores semelhantes e com menor número de células

in amatórias no sétimo dia quando comparados com o

G1, podendo-se, dessa forma, concluir que, com relação

à reação in amatória, esses 2 grupos estão mais próximos

do resultado da pomada de referência (G4). Já no grupo

G1, pode-se concluir que houve um atraso na primeira

fase da cicatrização devido à presença de maior número

de células in amatórias no sétimo dia.

Um estudo comparativo entre Extrato de Levedura,

Levedura de Cerveja e Spirulina  como complemento na

dieta de peixes com objetivo de avaliar o crescimento e

resposta hemato-imunológica de peixes evidenciou que a

Ficocianina possui e ciente atividade antiviral contra vários

vírus patógenos e tem capacidade de aumentar a resposta

imunológica e estimular a função dos macrófagos18 .

Em recente pesquisa23  realizada em ratos com lesões

de pele induzida, a aplicação de Ficocianina acelerou a

 primeira fase da cicatrização de feridas, rea rmando os

achados deste estudo.

Durante o 2º e 3º dias pós-trauma, os  broblastos agem

principalmente na proliferação e migração celular, formando

brose24 . Com estímulos adequados, os  brócitos revertem-se

para o estado de  broblastos e mio broblastos, reativando

sua capacidade de síntese24 .

Neste estudo, observou-se maior número de  brose

no grupo tratado com pomada em maior concentração de

Ficocianina (G3), o que sugere que em tal grupo, no 7º dia

pós-operatório, a fase de proliferação celular está mais adiantada

do que nos grupos tratados com pomada em menor

concentração de Ficocianina (G1 e G2).

 Em estudo23  realizado para examinar a propriedadede

cicatrização de Ficocianina em relação à proliferação de brócitos

em ratos, foi observado que a referida substância

aumentou a proliferação destes de maneira signi cativa.

Nesse mesmo estudo, os autores salientam que os dados

tangenciam o uso terapêutico da Ficocianina como agente

cicatrizante de feridas.

Neste estudo, a análise das áreas cruentas das feridas

excisionais mostrou haver maior taxa de contração, levando

a valores menores de área cruenta nos grupos tratados com

pomada em maior concentração de Ficocianina, ou seja, 30%.

Presente no tecido de granulação, o mio broblasto

é o principal tipo celular envolvido no reparo tecidual

 através da deposição de componentes da matriz extracelular

(tenascina,  bronectina, metaloproteinases e colágenos

I e III)25 . As melhores taxas de fechamento das feridas

dos grupos tratados com a pomada de Ficocianina 30%

podem ter relação com o número e/ou o aumento da função

dos mio broblastos.

As feridas não cicatrizadas geram problemas socioeconômicos,

com diminuição da produtividade e da qualidade

de vida dos indivíduos acometidos, o que pode

ser agravado se não for tratado com uma terapia tópica

adequada21 .

As limitações deste estudo referem-se às características

instintivas e anatômicas dos animais, não sendo possível

manter as lesões fechadas com gaze, o que diminuiu um

pouco o tempo de umidade oferecida ao leito da ferida, bem

como a absorção da exsudação quando necessário.

CONCLUSÃO

Conclui-se que o uso da pomada de Ficocianina na concentração

de 30% mostrou resultado semelhante à pomada

de referência – Kollagenase®, sendo capaz de promover a

contração mais rápida de feridas pela aceleração da primeira

fase da cicatrização e reação in amatória, maior concentração

de  brose e produção de colágeno total se comparada à

pomada de referência no mercado.

É válido ressaltar que a Ficocianina acelera o processo

cicatricial, caracterizando-se como um tratamento

e ciente e de baixo custo. Sugere-se novas pesquisas para

possível aplicação em seres humanos, o que possibilitaria

minimizar o sofrimento de pessoas com lesões cutâneas

e aprimorar a terapêutica disponível com melhor custo

aos cofres públicos.

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